Cellen te lijf met chiptechnologie

Reading time: 10 minutes

Author:

Met chiptechnologie hebben biologen en medici er een interessante techniek bij gekregen om tot op het niveau van individuele cellen te gaan. Wie er mee aan de slag wil gaan, heeft echter diepe zakken en een lange adem nodig. Wanneer is het de investering waard?

Uitzonderingen daargelaten – die zijn er altijd binnen de biologie – speelt de wereld van de celbiologie zich af op micrometerschaal: van een halve micrometer in lengte voor sommige bacteriën tot misschien honderd mu voor enkele van de typen cellen waar u en ik uit zijn opgebouwd. Chipfabricage speelt zich af op een schaal af die met gemak een of twee factoren kleiner is. Voor biomedici is het dus niet zo’n gek idee om eens een kijkje te nemen in de wereld van de IC’s om te zien of ze hun fijnste gereedschappen voor de interactie met cellen met deze technieken kunnen maken.

Het is dan ook niet lang zoeken om in Nederland verschillende partijen te vinden die met het idee bezig zijn. ‘Het is ontzettend in beweging, je kunt ontzettend veel doen met halfgeleidertechnologieën’, beaamt Peter van Stiphout. Hij kan er over meepraten: de Eindhovense Cytocentrics-vestiging, waar hij directeur van is, is gespecialiseerd in het toepassen van chiptechnieken voor biomedische doeleinden. Hij stipt ook gelijk het grootste probleem aan: het prijskaartje. Chipproductie kenmerkt zich door hoge opstartkosten die met de massaproductie van miljoenen exemplaren terugverdiend moeten worden. ‘Dat model staat eigenlijk haaks op de life sciences. Daar heb je vaak kleine bedrijfjes die met een beperkte markt beginnen’, zegt Van Stiphout.

Toch zijn de voordelen soms zo groot dat de kosten voor lief worden genomen. Dat is bijvoorbeeld het geval bij UT-spin-off Materiomics. Dit piepjonge bedrijf richt zich op een onderwerp dat lange tijd genegeerd is binnen de celbiologie: de oppervlaktestructuur waarop cellen groeien. ‘Implantaten die het lichaam in gaan, krijgen tegenwoordig vaak een generieke ruwheidsbehandeling. Maar we weten helemaal niet goed welke oppervlaktestructuren er echt nodig zijn’, vertelt Bernke Papenburg, die de dagelijkse leiding heeft over de onderneming.

Om dit probleem op te lossen, heeft Materiomics een chip ontwikkeld die tweeëntwintighonderd algoritmisch gegenereerde oppervlakken op een oppervlak van twee bij twee centimeter perst – in tweevoud. Bedrijven kunnen bij de start-up laten testen welke oppervlakken het gewenste gedrag stimuleren.

De chipaanpak is natuurlijk kostbaar, maar het is de enige methode om met voldoende precisie gecontroleerd driedimensionale structuren te creëren, geeft Papenburg aan. Ze denkt dat de markt best bereid is om voor de inzichten te betalen. Sterker nog: wanneer een klant eenmaal een interessant oppervlakte heeft gevonden, zal die specifieke chips willen hebben om hier verder mee te experimenteren.

Tweeduizend naaldjes

Ook bij Cytocentrics is alleen chiptechnologie geschikt om de piepkleine, concentrische pipetjes te maken die nodig zijn in de systemen die cellen automatisch vastpakken en de elektrische eigenschappen testen. ‘Maar dat is voortdurend passen en meten’, zegt Van Stiphout. ‘Soms moet je een kleinere chip ontwerpen. Of je moet een deel met behulp van chiptechnologie maken en de rest met goedkopere technieken, bijvoorbeeld door een chip in een groter geheel te assembleren.’

Dat is ook de aanpak van het Enschedese U-Needle, dat chiptechnieken gebruikt om naalden te maken voor injecties in de huid. ‘Heel interessant voor cosmetische toepassingen, vaccinatie en moderne medicijntoediening. Omdat de receptoren van je afweersysteem zich in de huid bevinden, is het zeer effectief om ook deze laag te triggeren met een vaccin of medicijn’, vertelt Marc van Barneveld van het bedrijf.

Een naaldje uit een waferfab is daar veel beter voor geschikt dan een traditionele stalen exemplaar. Dankzij de exacte controle over de structuur hebben de U-Needle-naalden een korte maar zeer scherpe tip en zijn ze loodrecht op de huid te plaatsen, terwijl stalen naalden met hun lange punt altijd schuin de huid in moeten en een hoop pijnreceptoren beroeren. Bovendien hebben de silicium naaldjes precies de juiste lengte voor de beoogde laag.

De naaldjes worden gemonteerd op een standaard verbindingsstuk voor een injectiespuit. Daardoor maken ze maar een klein deel uit van het totale systeem en vallen de kosten erg mee. ‘We werken nu met 100 mm wafers, daar halen we tweeduizend naaldjes uit. De kosten per naald gaan dan naar dertig eurocent bij een serie van anderhalf miljoen. En die prijs zit voornamelijk in de tijd voor het monteren en verlijmen, niet in het silicium’, doet Van Barneveld uit de doeken.

Ook Michel Klerks van het Wageningse Innosieve Diagnostics ziet de kosten niet als een probleem, maar weer om een andere reden. Zijn bedrijf gebruikt filters van siliciumnitride die dankzij een lithografische behandeling een exact bepaalde poriegrootte hebben. Ze worden ingezet in de procesindustrie om grote volumes lucht of vloeistof uit te pluizen op zaken als bacteriën en schimmelsporen.

‘Traditioneel moet je een monster in een labomgeving op kweek zetten. Meestal duurt het dan een paar dagen voordat je je antwoord hebt’, vertelt Klerks. ‘Onze methode is heel snel: binnen een uur weet je of er iets mis is. Daarnaast is ze heel gevoelig: we kunnen een paar micro-organismen detecteren in grote volumes. Dat is uniek, maar daar is wel lithografie voor nodig.’

Met afmetingen van vijf bij vijf millimeter zijn de materiaalkosten van de filters, die eenmalig worden gebruikt, niet verwaarloosbaar. Maar voor de klanten van Innosieve zijn de kosten van een test eigenlijk minder relevant dan de snelheid. Bovendien zijn de tests die ze vervangen ook niet goedkoop. ‘Een enkele analyse kost nu tussen de vijftien en twintig euro. Dat is al erg concurrerend, zeker gezien de grote toegevoegde waarde van snelheid’, zegt Klerks. ‘Bovendien kun je kijken naar indirecte kosten. Je kunt bijvoorbeeld onroerend goed uitsparen als je producten dankzij een snelle analyse niet in quarantaine hoeven te staan.’

Cytocentrics

Celmembranen zijn bezaaid met kanalen die selectief ionen naar binnen en buiten laten. Veel ziekten en medicijnen hebben op de een of andere manier met deze kanalen te maken. Om ze te bestuderen, zuigen biologen een cel met een minuscuul pipetje vast en maken ze het membraan daar open. Vervolgens is het transport van ionen te meten als een elektrisch verschil tussen de binnen- en buitenkant van het pipetje, bijvoorbeeld wanneer medicijnen worden toegevoegd.

Dit is natuurlijk nogal bewerkelijk voor bedrijven die grootschalige screenings willen uitvoeren. Daarom ontwikkelde Cytocentrics het Cytopatch-systeem, dat deze patch clamp-techniek volautomatisch uitvoert. Het hart wordt gevormd door een chip waarin twee concentrische pipetjes zijn geëtst met de benodigde kanalen: de een om de cel op zijn plaats te houden, de andere voor de meting.

Verantwoordelijk voor de ontwikkeling van deze chips is de vestiging op de High Tech Campus, waar met ‘buurman’ Philips Innovation Services een productiepartner binnen handbereik is. In de loop der jaren is de Eindhovense vestiging uitgegroeid tot specialist in het gebruik van chiptechnologie voor biologische toepassingen en zijn er ook externe partijen als klant bij gekomen. De groep ontwikkelt voor hen bijvoorbeeld filters en multi-elektrode-arrays: systemen vergelijkbaar met patch clamp-chips, maar dan om de elektrische activiteit van een groot aantal cellen tegelijk te meten.

Voor deze ontwikkeling is Cytocentrics Eindhoven het palet aan productietechnieken aan het uitbreiden; de arrays zijn te groot en de volumes te klein om geheel lithografisch uit te voeren. Vestigingsdirecteur Peter van Stiphout ziet er meer heil in alleen de kritieke componenten in de fab te laten maken en de rest van de array met meer conventionele technieken te produceren. ‘We zijn afgelopen jaar begonnen te kijken naar dit soort alternatieven. Nu zijn we bezig een netwerk van leveranciers op te bouwen die onze halfgeleidertechnologie met andere technieken kunnen aanvullen.’

Materiomics

Materiomics is in 2011 voortgekomen uit het promotieonderzoek van Bernke Papenburg aan de UT. De start-up is nog altijd gehuisvest bij de universiteit, waar ook de chips worden geproduceerd. ‘We zijn wel geheel onafhankelijk; we zitten alleen nog in transitie van een academische omgeving naar een zelfstandige bedrijf’, licht Papenburg toe. Haar onderneming richt zich op de vraag hoe cellen reageren op de oppervlaktestructuur waar ze op groeien. Met name vanuit de branche voor medische implantaten komt daar steeds meer aandacht voor. ‘Maar we weten helemaal niet of bijvoorbeeld vierkantjes of driehoekjes het beter doen. Daarom hebben we een high-throughput screeningsmethode ontwikkeld.’

Het idee om chiptechnieken in te zetten om en masse oppervlaktestructuren te genereren, ontstond toen Papenburg binnen haar groep in aanraking kwam met labchips. ‘Dit is natuurlijk wel even wat anders. Daar gaat het meestal om een paar lijntjes leggen; dit is vier vierkante centimeter high-density’, vertelt ze.

De screening wordt in eerste instantie uitgevoerd met de basischip van het bedrijf, waarop 2200 verschillende oppervlakken dubbel zijn aangebracht. Die zijn algoritmisch gegenereerd op basis van parameters als de vorm, de ruimte tussen structuren en de grootte ervan. ‘We maken het ontwerp in inverse in silicium en gebruiken dat als stempel voor het materiaal waar de klant in geïnteresseerd is. Als het om metaal gaat, stempelen we de afbeelding eerst in een dragermateriaal en leggen we daar een metaallaagje overheen’, legt Papenburg uit.

Na het opkweken van de cellen – minimaal in tienvoud – moet voor elk oppervlak worden geteld hoeveel cellen of hoeveel materiaal er aanwezig is. Daarvoor worden ze fluorescent aangekleurd, waarna de chip met een lijnscanner wordt gedigitaliseerd. Een stevig computercluster voert vervolgens een samen met de TU Delft ontwikkelde beeldverwerking uit.

Vanwege het benodigde specialisme dient Materiomics de screening als dienst aan: klanten sturen hun cellijnen op, het bedrijf voert de screening uit en stuurt de resultaten terug. Daarmee kan de klant weer verder inzoomen op het ideale oppervlak voor zijn cellen. Eventueel kan de spin-off een nieuwe chip genereren op basis van de gevonden parameters, of grotere oppervlakken van een interessante structuur voor verdere experimenten.

U-Needle

Ook U-Needle is gevestigd in Enschede, maar dit bedrijf is voortgekomen uit een ander bedrijf: Medspray, een onderneming die lithografisch nozzles produceert voor inhalatietoestellen. ‘Een klant vroeg of Medspray met zijn kennis over nozzles met kleine gaatjes ook geen scherpe structuren kon maken met kleine gaatjes. De directeur heeft toen in 2008 U-Needle opgericht’, vertelt Marc van Barneveld van het bedrijf.

Het zevenkoppige U-Needle werkt aan een alternatief voor de traditionele injectienaald dat veel minder pijn oplevert. Helaas voor de mensen met een naaldfobie: de toepassing beperkt zich tot specifieke niches. Naaldjes kunnen hooguit anderhalve millimeter lang zijn, anders zouden ze breken. Maar die lengte is ideaal voor de huid, die tot twee millimeter dik is.

‘Er zijn twee elementen verantwoordelijk voor de scherpte van een naald: de hoek van je wig en de radius van je tip’, legt Van Barneveld uit. ‘Een stalen naald is een holle buis die je schuin afslijpt. Je hebt dan een tip van 1,4 mm lang, waarbij je schuin de huid in moet prikken om lekken te voorkomen. Met een siliciumproces kun je die parameters op nanoschaal krijgen zodat je een heel platte maar heel scherpe naald kunt maken. De tip is bij ons slechts 0,3 millimeter lang. Daardoor kun je loodrecht op de huid prikken en raak je minder zenuwen, dus de patiënt ervaart minder pijn. Bovendien kunnen we de lengte precies bepalen zodat je op de juiste huidlaag zit. Het wordt dan een soort stempelen.’

Met de toegang tot de huid mikt U-Needle op de cosmetische industrie – denk aan botox en fillers – en op vaccinatie en nieuwe vormen van medicijnen toedienen. Het bedrijf maakt op aanvraag naalden met specifieke karakteristieken waarmee zij vervolgens een eigen product ontwikkelen. Op dit moment zitten zijn klanten in de certificeringstrajecten van hun oplossingen – de naaldjes worden dus wel verkocht, maar zijn nog niet ‘op de markt’.

Als het zover is, zal het bedrijf flink moeten opschalen. Daarom zoekt het zo veel mogelijk aansluiting bij een standaard chipproductieflow. Op dit moment worden de chips bij Mesa+ geproduceerd, maar volgens Van Barneveld kan het in principe in elke foundry. Het back-endproces is een ander verhaal. U-Needle heeft nu een eigen machine staan om de naaldjes in de plastic houder te lijmen. Maar dat schaalt lastig. ‘We willen dat ook kunnen uitbesteden aan een normale die-bonder-partij, dus we zijn aan het kijken hoe we een standaard die-bond-machine met een eigen toolset hetzelfde kunnen laten doen’, aldus Van Barneveld.

Innosieve Diagnostics

Enkele tientallen schimmelsporen die in een kas rondzweven, een paar salmonellabacteriën op de groente of wat legionellacellen in het drinkwater zijn al genoeg om voor problemen te zorgen. Tijdens de kwaliteitscontrole is het dan ook belangrijk om dit soort cellen op te sporen, maar met een celgrootte gemeten in micrometers is het zoeken naar een speld in een hooiberg. Traditioneel wordt daarom een indirecte opsporingsmethode gebruikt: een monster wordt opgekweekt in de omstandigheden waarbij de cellen in kwestie zich het best voelen, zodat ze zich vermenigvuldigen tot aantallen die wél te zien zijn.

Dat moet beter kunnen, bedacht Wageningen UR-onderzoeker Michel Klerks zich toen hij jaren geleden de filters van het Zutphense Aquamarijn in handen kreeg. Dankzij chiplithografie hebben die exact gespecificeerde poriegroottes en zijn ze perfect plat. ‘Daarmee kun je een groot volume zonder al te veel problemen filtreren en blijven alle cellen waarin je geïnteresseerd bent achter. Die kun je daarna direct optisch inspecteren’, vertelt Klerks.

Vijf jaar geleden richtte hij het bedrijf Innosieve Diagnostics op om het idee te vermarkten. ‘Je voert de filtratie uit met een luchtpompje, of een centrifuge voor vloeistoffen. Met CCM hebben we een apparaat ontwikkeld om de visuele inspectie vervolgens automatisch uit te voeren, de Muscan. Je kleurt de micro-organismen fluorescent aan met specifieke antilichamen of DNA-probes of met generieke kleurstoffen. Het apparaat scant vervolgens het oppervlak van het membraan en de software telt het aantal micro-organismen.’

De grootste voordelen zijn de snelheid en de gevoeligheid. Een totale test kan binnen het uur zijn afgerond, en slechts een paar cellen zijn al te detecteren in een groot volume. ‘Bij één cel is het echt wel heel lastig om aan te tonen dat je boven de achtergrondruis zit, dus wij hanteren een detectielimiet van een tot drie cellen’, zegt Klerks. Ook is de procedure eenvoudiger. Het filtreren, kleuren en laden van de scanner zijn – althans op dit moment – handmatige stappen, maar een lab is niet meer nodig. ‘Je kunt de hele test op locatie uitvoeren, bij wijze van spreken op een tafel naast de lopende band.’

Voor de meeste toepassingen worden filters ingezet met poriegroottes van 0,45 micrometer, klein genoeg om bacteriën tegen te houden. Maar grotere gaatjes zijn net zo makkelijk te maken. Dat opent in de toekomst ook de deur naar andere toepassingen. Klerks: ‘Met poriën van vijf micrometer kun je cellen in het bloed filteren. We hebben net een project afgerond voor het opsporen van specifieke cellen in milliliters bloed. Daar gaan we binnenkort vervolg aan geven.’